Analysis of Swine Leukocyte Antigen Peptide Binding Profiles and the Identification of T cell Epitopes by Tetramer Staining

Abstract

Immunsystemet har udviklet sig på en sådan måde, at det er i stand til specifikt at skelne mellem selv og ikke-selv strukturer. Ved at kombinere dette med evnen til effektivt at huske og forberede sig imod samtlige patogener, som det tidligere er stødt på, er af afgørende betydning for et korrekt og effektivt fungerende immunsystem og er selve grundstenen i ethvert design af vacciner. I alle hvirveldyr overvåger kroppens CD8+ cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er) det intracellulære miljø i søgen efter tegn på invasion af udefrakommende patogene organismer såsom virus og bakterier. CTL'er overvåger major histocompatibilitets kompleks (MHC) klasse I molekyler, som er stærkt polymorfe peptid-receptorer, der udvælger og præsenterer endogent afledte peptider til cirkulerende CTL'er. Peptider, der genkendes af CTL'er i samspil med MHC molekylet, er såkaldte epitoper og repræsenterer et lille fragment af det patogene proteom, hvilket gør det muligt for immunsystemet specifikt at identificere og reagere imod fremmede peptid fragmenter, som er unikke for den invaderende patogen. MHC molekylets polymorfi er det, der individualiserer immunresponset for hvert enkelt individ i en given art. Endvidere genkender kroppens T-celler kun antigene peptid ligander, når de fremstår som del af det trimere peptid:MHC:β2m (pMHC) kompleks.Genet der koder for MHC er kendt som en af de mest polymorfe regioner i genomet. Til trods for eksistensen af tusindvis af forskellige humane leukocyt antigen (HLA) varianter, arver og udtrykker hvert medlem af en art kun et par stykker af disse MHC alleler. Selve "MHC fingeraftrykket" udtrykt af et individ, kan identificeres ved at definere MHC alleler. Den unikke MHC allel kan fastslås ved en metode, traditionelt kendt som ”vævstypebestemmelse”, som foretages ved at analysere perifere blod cellers reaktivitet overfor vævstypnings-sera. En sådan viden er afgørende, for at kunne analysere et immunrespons i forhold til MHC restriktion og CTL genkendelse af patogen-specifikke proteiner.Størstedelen af MHC proteinets polymorfi er lokaliseret i den peptidbindende kløft. Derfor er hvert enkelt MHC molekyle unikt i måden det binder peptid-antigener på og som følge heraf individualiseres også hele individets T-celle repertoire via MHC. På denne måde er de enkelte MHC molekylers forskellighed indenfor en bestemt art medvirkende til, at det stort set er umuligt for indtrængende patogener, at undslippe immun systemets søgelys.Karakterisering af individuelle SLA klasse I- og klasse II gen produkter og deres unikke peptid bindende kriterier definerer T-celle epitoper fra ethvert givent patogen proteom.Til dato er analysen af MHC klasse I molekylets evne til at binde og præsentere peptider, både i form af bindingsstyrke (affinitet) og stabilitet af peptid:MHC komplekset, blevet omfattende beskrevet i både mus og mennesker. Sådanne data er stadig relativt begrænsede for landbrugs dyr såsom svin. Denne ph.d. afhandling beskriver hvorledes analytiske tilgange, der oprindeligt er udviklet til mennesker og mus, kan tilpasses og anvendes i grise, for at opnå en bedre forståelse af de porcine MHC klasse I molekylers peptid-bindings karakteristika i forbindelse med immun responser rejst imod vaccinering eller infektion. En sådan anvendelse af tidligere afprøvede analyse metoder sammen med nyligt producerede, rekombinante SLA klasse I proteiner, førte til en betydelig mængde data for peptid:SLA:β2m (pSLA) kompleksets affinitet og stabilitet. Kortlægning af SLA proteinernes bindingsmotiver samt identifikationen af matchende virale peptider, gjorde det muligt at undersøge beskaffenheden af de forskellige SLA proteiner samt de roller, de spiller i etableringen af adaptiv immunitet. Udviklingen af pSLAbaserede tetramerer muliggjorde endvidere studier af specifikke CTL responser fremkaldt som et resultat af immunisering mod mund- og klovesyge virus (MKS) og svine influenza A virus.Disse undersøgelser resulterede i identifikationen af T-celle epitoper fra begge virus.Med stadigt stigende mængder peptid bindings data for de forskellige SLA molekyler, opnået igennem disse samt andres studier, er det muligt for vores samarbejdspartnere på Center for Biologisk Sekvensanalyse (CBS), DTU, yderligere at styrke og forbedre den peptid forudsigende algoritme NetMHCpan. Denne forudsigelses algoritme er nu i stand til at udpege peptid kandidater til binding af både humane (HLA), kvæg (BoLA) og svine (SLA) MHC proteiner.Ved at udvide kendskabet til porcine MHC klasse I molekyler, kortlægge deres peptid bindings motiver og producere pSLA baserede tetramerer, samt forbedre nutidens aktuelle tekniske niveau indenfor metoder til at forudsige SLA peptid binding, kan vi modernisere immunologisk videnskabelige studier i landbrugs dyr. Disse fremgangsmåder og resultater må forventes at føre til en fremskyndet og forbedret udvikling af vacciner med forøget effektivitet, på grund af optimal aktivering af det cellemedierede immunrespons med tilhørende minimale bivirkninger.The immune system has evolved in such a way that it is capable of specifically distinguishing between self and non-self structures. Combining this with the ability to memorize and strongly prepare for all pathogens that it has previously encountered, is essential for the proper and effective function of the immune system, and provides the cornerstone for vaccine design. In all vertebrate animals, CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) survey the intracellular environment for signs of invasion by pathogenic organisms such as viruses and bacteria. CTLs survey major histocompatibility complex (MHC) class I molecules, which are highly polymorphic peptide receptors which select and present endogenously derived peptides to circulating CTLs. Peptides that are recognized by CTLs in the context of MHC are epitopes, and represent a small sample of the pathogen proteome, making it possible for the immune system to specifically identify and react upon non-self peptide fragments unique only to the foreign intruder. The polymorphism of the MHC molecule effectively individualizes the immune response of each member of any given species. Moreover, responding T cells recognize antigen ligands, only in the context of peptide:MHC:β2m (pMHC) complex.The gene encoding the MHC is one of the most polymorphic regions of the genome known. Despite thousands of different human leukocyte antigen (HLA) variants identified, each member of a species only inherits and expresses a few of these MHC alleles. The “MHC fingerprint” of an individual can be identified by defining MHC alleles. This is classically called “tissue typing” and is done by analyzing the reactivity of peripheral blood cells with sera unique to MHC alleles. Such knowledge is paramount to analysis of the immune response regarding MHC restriction and CTL recognition of pathogen-specific proteins.Most of the polymorphism of MHC proteins is resident in the peptide binding groove. Hence, each MHC is unique in the way it binds peptides, and by inference it individualizes the entire T cell repertoire of the host. In this way, the diversity of MHC within a species makes immune escape almost impossible for any intruding pathogen.Characterization of the SLA class I and class II gene products and their peptide binding capacity defines the T cell epitopes of any given pathogen proteome.To date the analysis of MHC peptide interactions, strength (affinity) and stability of the peptide:MHC complex, has been extensively reported in mice and humans, whereas data for livestock animals such as the pig is rather limited. This thesis describes adapting and applying analytical approaches, originally developed for man and mice to understand porcine MHC class I peptide binding characteristics in relation to immune responses to vaccination or infection.Applying proven technologies to newly produced, recombinant swine leukocyte antigen (SLA) class I proteins yielded a body of data for peptide:SLA:β2m (pSLA) complex affinity and stability.Mapping the SLA proteins for their peptide binding requirements along with the identification of their cognate virally derived peptides, made it possible to explore the nature of the SLA proteins and the roles they play in establishing adaptive immunity. The development of SLA tetramers, enabled investigation of the specific CTL response elicited as a result of immunization against foot-and-mouth-disease virus (FMDV) and swine influenza A virus. These studies resulted in the identification of T cell epitopes from both viruses.As SLA:peptide binding data accumulates in these and similar studies, it becomes possible for collaborators at Center for Biological Sequence Analysis (CBS), DTU, to further strengthen the NetMHCpan algorithm. This prediction tool now has the capacity for the selection of peptide candidates to be bound by human (HLA), bovine (bovine leukocyte antigen (BoLA)) and swine (SLA) MHC proteins.Expanding the knowledge of porcine MHC class I molecules, mapping their peptide binding matrices, and producing tetramers as well as improving today’s state-of-the-art method for SLA peptide prediction will modernize immunological science of livestock species. These approaches and results should lead to accelerated development of vaccines with increased efficacy due to optimal activation of cell-mediated immune responses with minimal adverse events