Biosynthesis of a G-Quadruplex—forming sequence and its stabilization by ligands

Abstract

In addition to the Watson and Crick B-form duplex DNA, G-quadruplexes are four-stranded DNA structures formed in vivo by the self-assembly of guanine-rich sequences. These can be formed by one, two or four separate strands of DNA and present a diversity of topologies, defined by the strand orientation, loop size and sequence. G-quadruplexes can be found in telomeres, immunoglobulin switch regions and gene promoter regions. The biological relevant location on the genome makes these high-order structures an attractive target for drug design and the development of highly specific ligands that bind and stabilize G-quadruplex with therapeutic activity. Herein, the biosynthesis of a novel G-rich quadruplex-forming DNA sequence 58Sγ3 is described by plasmid amplification. The recovery and purification of 58Sγ3 oligonucleotide using size-exclusion chromatography is presented. The G-quadruplex formation is promoted and its topology is determined by circular dichroism. The stabilization of the G-quadruplex structure with quinoline and naphthalene-based derivatives is studied using melting analysis, G4-FID and PCR-stop assays. The results suggest that 58Sγ3 folds into a parallel-stranded G-quadruplex structure in 500 mM KCl buffer and that naphthalene-based ligands bind and stabilize the G-quadruplex structure. The ligands are also found to be quadruplex-specific over duplex DNA and inhibit Taq DNA polymerase. This work provides evidence for G-quadruplex formation within the immunoglobulin switch regions. Furthermore, it is suggested that the novel ligands here reported act as potent specific G-quadruplex binders and may also potentially be used to inhibit genes transcription in tumor cells.Além da forma B Watson e Crick do ADN duplex, os G-quadruplexes são estruturas de ADN de quatro cadeias, formadas in vivo pela auto-associação de sequências ricas em guaninas. Estas podem ser formadas por uma, duas ou quatro cadeias distintas de ADN e apresentar uma diversidade de topologias, definidas pela orientação da cadeia, tamanho dos loops e a sequência. G-quadruplexes podem ser encontrados nos telómeros, regiões de troca das imunoglobulinas e nas regiões dos promotores génicos. A localização biologicamente relevante no genoma faz com que estas estruturas altamente ordenadas sejam um alvo atrativo do desenho de fármacos e o desenvolvimento de ligandos altamente específicos que ligam e estabilizam o G-quadruplex com ação terapêutica. Neste trabalho, descreve-se a biossíntese da nova sequência de ADN rica em guaninas e formadora de G-quadruplex 58Sγ3, utilizando amplificação por plasmídeo. A recuperação e purificação do oligonucleótido 58Sγ3 é efetuada por cromatografia de exclusão molecular. A formação de G-quadruplex é promovida e a sua topologia é determinada por dicroísmo circular. A estabilização da estrutura do G-quadruplex com ligandos derivados de quinolina e naftaleno é estudada utilizando ensaios de estabilização térmica no dicroísmo circular, G4-FID e PCR-stop. Os resultados sugerem que 58Sγ3 adota uma estrutura G-quadruplex paralela em tampão 500 mM KCl e que os ligandos de naftaleno ligam e estabilizam a estrutura do G-quadruplex. Os ligandos demonstraram também ser específicos do G-quadruplex em relação ao ADN duplex além de inibir a Taq ADN polimerase. Este trabalho fornece evidência da formação de G-quadruplex nas regiões de troca das imunoglobulinas. Além disso, sugere que os derivados de naftaleno atuam como ligandos do G-quadruplex e que podem ser potencialmente utilizados para inibir a transcrição de genes em células tumorais